食品发酵是人类历史上最古老的利用微生物进行生产实践的行为，不同人群文化对食品发酵有各自的偏好，生业模式的转变及农业发展也和发酵技术的演变息息相关。发酵奶制品很可能是最早出现的发酵食品，尽管人类食用发酵奶制品的历史悠久，但目前关于人类历史上对发酵微生物的应用和技术交流历史，以及发酵微生物本身的演化过程，特别是发酵微生物在长时间驯化条件下功能性基因的演变知之甚少。对此，针对古代发酵奶制品展开系统的古微生物基因组研究，成为探究这些问题的关键手段。
图1. 新疆小河墓地出土的木乃伊样本(被称为“小河公主”，奶酪样本即围绕在其脖子周围）
(图片来自新疆维吾尔自治区考古研究所 李文瑛）
北京时间9月25日，Cell杂志在线发表中国科学院古脊椎动物与古人类研究所（以下称“古脊椎所”）付巧妹研究团队联合中国科学院大学人文学院杨益民教授与新疆文物考古研究所、新疆大学、国家文物局考古研究中心、北京大学第三医院等单位合作针对新疆小河墓地出土“最古老奶酪”的系统性古微生物基因组研究成果“Bronze Age cheese reveals human-Lactobacillus interactions over evolutionary history”（ 论文主要完成人付巧妹，刘逸宸、杨益民）。该研究被选为Cell重点推荐论文，是国际首个古代奶制品遗存宏基因组研究。付巧妹团队历经11年探索和研究，自主设计乳酸菌全基因组位点探针，将开菲尔奶酪样品中的乳酸菌DNA从0.43-0.55%富集提升至64-80%，使得第一例古代全基因组研究成为可能。研究从距今约3，500年的3例古老奶酪样本中提取出26x高质量的古代开菲尔中的乳酸菌（Lactobacillus kefiranofaciens）基因组，发现其形成不同于欧洲菌株的分支，揭示开菲尔乳酸菌的另一独立的、东亚内陆传播路线;且通过探索开菲尔乳酸菌适应性演化历程，厘清新疆塔里木盆地古人群的生活方式，技术文化的交流和发展，及在进化时间尺度上开菲尔乳酸菌与人群协同演化、互利共生的分子机制。
图2. 新疆小河墓地出土、编号为M25的青铜时代奶酪样本
(图片来自中国科学院大学人文学院 杨益民）
一、古代新疆人群对开菲尔酸奶的应用和传播历史
新疆小河墓地出土的“奶酪”样本是迄今发现最早的奶酪制品，且在此前通过古蛋白质组学被鉴定为开菲尔奶酪，其来源自开菲尔酸奶，由开菲尔粒（类似酒曲）在奶中发酵而成。通过重建其发酵微生物群落，该研究进一步确证该奶酪制品由开菲尔乳酸菌发酵生产，而且用于制作开菲尔奶酪的产奶山羊来自新石器时代之后广泛分布在欧亚大陆的一个支系，而非东亚内陆地区同时期分布的驯化山羊。该结果表明新疆塔里木盆地古人群对开菲尔的开发很可能与该时期与欧亚草原人群的交流有关。
图3. 新疆小河墓地出土、编号为M29的青铜时代奶酪样本
(图片来自中国科学院古脊椎动物与古人类研究所 平婉菁）
奶制品发酵技术的传播在很大程度上伴随着人类的迁徙和互动，这一过程推动了在发酵作用中发挥重要作用的乳酸菌演化。该研究通过对新疆古代开菲尔乳酸菌的系统发育关系分析，揭示了开菲尔乳酸菌的一条新的传播路线。研究发现用于发酵的开菲尔乳酸菌分两个重要支系，一个支系主要包括来自欧洲（德国）、亚洲沿海和岛屿地区（广东、台湾岛、日本和新加坡）的菌株，该支系符合从高加索扩散到欧洲及亚洲和东南亚沿海地区的扩散路线，而另一支系主要包括分布在东亚内陆地区（包括西藏）的菌株，新疆塔里木盆地古人群用于发酵开菲尔酸奶的菌株便来自该支系，且处在基部位置，这就表明存在另一条通过技术文化交流将开菲尔酸奶制作工艺从新疆地区传播至东亚内陆的传播路线。
图4. 开菲尔乳酸菌的传播路线和演化历史
由此可见，开菲尔乳酸菌两个支系的分化很可能就是其共同祖先最初被驯化后在不同人群的传播所导致的，
代表不同古人群在应用和驯化发酵微生物过程中发生了不同路线的迁徙与交流。
二、古人群与发酵微生物的协同演化历史
古人群通过食用发酵奶制品摄入大量发酵微生物，而这些有益的共生微生物伴随着环境压力、人类活动、技术文化的变迁，及通过长时间与人类体内其他肠道微生物群落的相互作用，其本身基因组也发生了相应的演变，开菲尔乳酸菌的演化亦是如此。通过对青铜时代和现代开菲尔乳酸菌基因组的比较分析，研究得以探究过去数千年里开菲尔乳酸菌的适应性演化特点，同时反映出古人群与该共生微生物的协同演化历史。
图5. 新疆小河墓地平面图、出土样本及奶酪样本中的微生物组成
(A）新疆小河墓地平面图;(B）新疆小河墓地出土的木乃伊样本;(C）本研究获得微生物基因组的
三组青铜时代奶酪样本;(D）奶酪样本中的微生物DNA组成
广泛的水平基因转移是乳酸菌适应性演化的主要机制之一。研究通过比较新疆3，500年前的开菲尔乳酸菌和现代开菲尔乳酸菌菌株的功能性基因，发现开菲尔乳酸菌的演化主要体现在三个方面:一是对环境压力的适应性，相比于青铜时代的开菲尔乳酸菌，现代开菲尔乳酸菌的菌株中出现了可能参与到耐药机制的基因簇。二是细菌基因组防御机制的增强，现代开菲尔乳酸菌出现与细菌自身免疫相关的R-M系统和toxin-antitoxin系统等基因簇，这些基因簇能对抗外源DNA入侵，从而维持基因组的稳定性。三是对人类肠道环境相关的适应，现代开菲尔乳酸菌的菌株中出现了与细胞壁表面结构及潜在的与宿主会发生相互作用的基因簇，这些基因簇的出现很可能与其自身和人类的长期互动有关。
图6. 古代开菲尔乳酸菌和现代开菲尔乳酸菌的功能性基因分布和水平基因转移
(A）古代和现代开菲尔乳酸菌菌株的主要功能性基因的比例;(B）古代和现代开菲尔乳酸菌菌株的主要功能性基因的分布;
（C）古代和现代开菲尔乳酸菌菌株基因组可能的水平基因转移区域
比如，研究发现人类长时间的应用和驯化很可能也影响了开菲尔乳酸菌的演化。相比于新疆地区青铜时代的开菲尔乳酸菌而言，西藏地区的现代开菲尔乳酸菌菌株中出现了两个与减轻肠道炎症反应相关的水平转移的基因簇，这些基因簇不仅有利于乳杆菌在人类肠道中生存，而且能促进肠道功能。考虑到开菲尔酸奶的制作是通过开菲尔粒进行，而古人群在贸易交流中能够很方便交易开菲尔粒，那么这些基因簇的出现很可能与当时人群对携带不同支系开菲尔乳酸菌的开菲尔粒的偏好有关。由此来看，开菲尔乳酸菌这样长时间被人类驯化利用的菌株，其基因组演化除了菌株本身的适应性演化外，也是人类长时间对微生物具偏好性驯化的结果。
微生物与人类的相互作用贯穿了人类数百万年的演化历史，数以亿计的的微生物与人类共生，参与到人类体内营养的合成与毒素的分解，在人类健康及其与环境的高度互动中扮演了重要角色。该研究以与人类活动和生业模式息息相关的共生微生物为突破口，用前所未有的古分子证据揭开过去人群对微生物的应用驯化和传播交流历史，从分子机制层面厘清相关菌株的引入、传播和演变历程，为深入理解相关人群技术文化的交流和发展，与环境高度动态的相互作用提供了全新思路和独特维度。国际相关专家评价，“这是领域里很罕见的挖掘全新数据的古DNA研究”，“这一首例来自考古样本的共生微生物基因组意义重大，为欧亚草原中部人群的迁徙交流与微生物驯化历史带来新认识”。
相关研究得到国家自然科学基金、中国科学院、生物医学峰基金、中央高校基本科研业务费经费支持。
论文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674（24）00899-7
编辑：诸鹏飞
审核：盛捷